大家好，我是青医17级李雨景，现就读于首都医科大学附属北京胸科医院 临床病理学专业。目前博士大课题为肺癌类器官的构建与鉴定。
我们课题组作为北京较早进行肺癌类器官平台搭建的课题组，在肺癌类器官的样本来源、构建、鉴定等方面走过了不少弯路，从最早与领域内前沿公司合作，到现在独立构建类器官，终于初步建立了肺癌类器官培养体系与流程，现就类器官相关知识进行梳理与科普，欢迎大家批评指正。
一、什么是类器官？
简单说，类器官是在实验室里培育出的、具有三维结构的微型组织。与细胞实验中3D培养的“球状体”不同，它最大的特点不是一堆细胞，而是能像真实器官一样自我组织，形成具有特定空间结构和功能的复杂单元。可以把它理解为：利用干细胞（种子细胞）或直接从组织中取出的细胞，在培养皿中为它们创造了一个接近体内的生长环境。这些细胞会自己按照发育程序，长成类似大脑、肝脏、肠道、肾脏等器官的复杂结构。
疾病建模中的不同类型的类器官
多能干细胞和组织干细胞来源的人类类器官
二、类器官的种子怎么来？
类器官的培育核心就是种子细胞，也就是干细胞，这类细胞能自我更新，还能分化成不同类型的细胞。目前常用的种子细胞主要有两类：
来源一 患者来源细胞（患者来源类器官，PDOs)
这是我们课题组所做的方向。直接用患者的组织（健康/肿瘤组织）或体液中的细胞培育，这些细胞本身就带有组织记忆，在合适的因子（如激活Wnt通路等）刺激下，能自我更新并形成类器官。
因为类器官种子来源于患者，因此能保留患者器官的原有特征，包括成熟组织的表型、复杂的细胞异质性和患者特异性疾病状态。
它的细胞来源遗传多样性高，还能构建生物样本库（也就是我们现在在做的），是疾病建模（尤其是癌症）和个性化药物筛选的常用模型。
与患者来源异种移植模型（PDX）相比，PDOs成本更低、通量更高，且避免了动物实验相关的伦理问题。
患者来源类器官的构建示意图
来源二 多能干细胞（胚胎干细胞ESC／诱导多能干细胞iPSC）
诱导多能干细胞（iPSC）是通过重编程体细胞得到的，胚胎干细胞（ESC）来自囊胚的内细胞团，两者都能分化成多种细胞类型。PSC来源类器官常出现增殖能力下降、成熟度不足的问题，多停留在类似胎儿阶段的未成熟状态，因此更适用于器官发生研究。ESC来源类器官成熟度更高，可模拟器官发生后期阶段，但其来源涉及显著的伦理争议。
这种来源的类器官与我们研究方向不太相符，不过多赘述。有些儿科、心内科（心肌重编程）等课题组会用到这项技术。
三、PDOs构建流程
- 样本样本获取与处理
手术/活检样本：首先获取手术切除或活检样本（在不影响临床诊断的情况下使用），放入组织保存液低温运送至实验室。离体到放入组织保存液不宜超过2h。之后在无菌环境下，剔除坏死部分和正常组织，用PBS缓冲液清洗干净。
体液样本：胸水、心包积液、脑脊液等将体液分装离心，富集管底细胞沉淀。如果血细胞过多，需加入红细胞裂解液。
2.组织消化与细胞分离（体液样本无需处理）
将组织剪成1-2立方毫米的小块，用胶原酶等配制的消化液进行处理，通常在37℃下消化30分钟。目的是获得单细胞或细胞簇，之后用红细胞裂解液去除红细胞并过滤。随后用细胞活性检测仪检测活性并进行细胞计数。
3.基质胶包埋与培养
将分离的细胞与基质胶混合后，滴加到培养板中凝固。待其凝固后，加入专用的类器官完全培养基。
4.传代与扩增
每6-12天，根据类器官的生长密度和培养基颜色变化，进行传代。通过物理吹打或TrypLE消化酶将类器官分散成小块，按1：2或1：3的比例重新包埋。
5.等到类器官大小长至50～100um时，可收集类器官进行测序，使用琼脂糖进行包埋，随后用福尔马林固定后做HE、免疫组化染色。
肠道类器官构建流程
四、做类器官研究需要的条件
可能有小伙伴也想做类器官相关课题，接下来就简要介绍一下做类器官相关课题需要的条件：
1.硬件设施
与细胞培养相差不多，都需要培养箱、倒置显微镜、液氮罐和-80冰箱、离心机，除此之外还有细胞计数仪、细胞活性检测仪，如果做药敏还有酶标仪
2.核心试剂耗材
保存液、基质胶、类器官专用培养基、各种类器官生长因子、小分子抑制剂、TrypLE、消化液、冻存液等
3.资金与伦理
类器官研究属于高投入研究，每一步都在燃烧经费。
做类器官每天都要用到的基质胶（约5000元/10ml）培养基（约7000元/500ml），相关生长因子都价格不菲。
类器官每一例每一代都需要测序（二代测序约1000元/例，三代测序约1.5w/芯片，可测50～100例），也是不小的成本。
此外，类器官课题牵扯到的伦理问题也较为敏感，使用人体组织样本必须通过医院或机构的伦理委员会审查，并确保与患者签署知情同意书。我们课题过伦理、签知情同意都花了非常多的精力。
五、类器官能够说明什么问题
类器官的价值在于，它比传统的2D细胞系和动物模型，能更真实地反映人体生理。核心可以归纳为三个层面：
1.机制研究
它可以用于构建疾病模型，引入特定突变，或从患者组织中培养，来研究细胞癌变、遗传病或传染病的机制。现在非常多的文章或本子都会加上类器官层次的验证。
2.药效与毒性
类器官最广泛的应用是药物敏感性测试，现在已经有公司实现了类器官全自动药敏检测。通过对患者来源的类器官进行药筛，可以预测药物在个体中的反应，指导临床用药。
3.精准医疗
这是目前最接近临床应用的方向。通过将患者的肿瘤类器官与临床药物一一对比，找出最有效的方案，也就是“类器官辅助治疗”。此外，它还能用于筛选新药，且比动物模型更能代表不同人群的遗传背景。但目前还在科研阶段，没有投入临床使用。
总体而言，类器官作为一项近年来的新兴技术，在国内外都受到了较多关注。22年FDA2.0更是打破了以往新药研发必须经过动物试验的强制要求，可以使用类器官或细胞芯片等模型；国内也喊出了在类器官领域“弯道超车”的口号。类器官能在体外模拟人体器官的功能，尤其是在药敏领域有独特的优势。但类器官培养周期长、成本高，且现在类器官的培养也没有体系化，每个课题组都有不太一样的流程，培养基也都是不太一样的配方，鉴定等也较为困难（指肺癌类器官）。如果要做这个领域，不建议开展纯类器官研究，而可以将其作为现有研究的补充验证手段，为课题“锦上添花”，在降低风险的同时发挥其独特价值。
以上都是我作为初入类器官研究领域的一些看法，许多地方不太严谨，欢迎相关方向的小伙伴们一起交流讨论～
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