科盾+基础研究+实验技能+小鼠肝脏免疫细胞提取方法

[青医-2012级-翟兴冉]

大家好，我是青医12级翟兴冉，科研型硕博毕业于北医系统的教学医院，解放军总医院第五医学中心（原解放军302医院），专业方向为肝病，博士期间主要从事肝病相关的临床和基础研究，目前在山东省立医院感染性疾病科工作，规培第2年中。

在此跟大家分享一项实验技术：小鼠肝脏免疫细胞提取方法。此方法经“借鉴课题组前人经验+查阅文献+实践验证”后切实可行，主要采用体内胶原酶灌注消化的方式，对肝内免疫细胞，尤其是巨噬细胞，包括Kupffer细胞和单核来源的巨噬细胞（MoMFs），提取效果较好。缺点是相较体外消化，过程较复杂，单次实验提取小鼠数量有限（我最多一次提8只）。提取出的免疫细胞可用于后续流式染色等实验。

以下是详细实验步骤：

1.关键实验试剂
实验试剂名称 厂家 货号
IV型胶原酶 美国Gibco公司 17104019
DNase I 瑞士Roche公司 11284932001
无钙镁HBSS溶液 美国Gibco公司 14170112
EDTA溶液 中科迈晨（北京）科技有限责任公司 MC011.1
牛血清白蛋白（BSA） 北京百瑞极生物科技有限公司 BN20800
氯化钙溶液（CaCl2） 北京索莱宝科技有限公司 G0070
Percoll 英国Cytiva公司 17089101
10×PBS 中科迈晨（北京）科技有限责任公司 CC008.1

2.溶液配制：
（1）前灌注液：含0.5 mM EDTA的无钙镁HBSS溶液，每只鼠50 ml。
（2）酶I（原位消化）：含0.375 mg/ml IV型胶原酶、10 μg/ml DNase I、5 mg/ml BSA、5 mM CaCl2的高糖DMEM溶液，每只鼠40 ml。
（3）酶II（体外消化）：同酶I，每只鼠10 ml。
（4）终止液：含5 mg/ml BSA、5 mM EDTA的高糖DMEM溶液，每只鼠10 ml。
（5）维持液：含2% FBS的1×PBS溶液，每只鼠20 ml。
（6）33% Percoll：先将Percoll与10×PBS按9:1的比例配制，是为100% Percoll，临用前再用Percoll与HBSS配制为含33% Percoll的HBSS溶液，每只鼠12 ml。

3.实验步骤：
（1）准备工作：提前30 min打开水浴锅，设置为37℃，预热前灌注液、酶I、酶II溶液。设置恒流泵流速5 rpm/min，依次用75%酒精、生理盐水、前灌注液冲洗恒流泵管路各10 min，确保没有气泡。
（2）麻醉、扎针：麻醉小鼠，腹部消毒，剖开腹部，暴露门静脉和下腔静脉。将恒流泵流速减至0.3 rpm/min，从门静脉进针，止血夹固定，判断灌注是否成功。成功后快速剪开下腔静脉，升高流速至18 rpm/min。
（3）前灌注液：用镊子夹闭下腔静脉，使肝脏膨胀，保持10-20秒，再次判断是否灌注成功。确定成功后，灌注约10-15 min。
（4）酶I消化：暂停恒流泵，将前灌注液改为酶I溶液，继续用18 rpm/min的流速灌注。灌注期间，用镊子夹闭下腔静脉，使肝脏膨胀，保持10-20秒，反复几次，有利于肝细胞的解离，减少灌注时间，灌注10-15 min后，出现龟裂纹说明肝细胞已解离。
（5）酶II消化：剪下肝脏，置于10 ml预冷的高糖DMEM中备用，临剥膜前换为10 ml酶II溶液，用两把镊子剥离肝脏包膜，拆碎肝脏，转移到50 ml离心管中，37 ℃水浴，上下颠倒，消化20 min。
（6）过筛：用一次性吸管吹打均匀细胞悬液，加10 ml终止液中止消化，用直径70 μm的细胞筛网过滤，分装到15 ml离心管中。
（7）去除实质细胞：将细胞悬液离心，50 g，5 min，沉淀为实质细胞，上清为非实质细胞，取上清。
（8）密度梯度离心纯化肝内免疫细胞：将上清离心，500 g，5 min，使非实质细胞沉淀。弃上清，用10 ml 维持液重悬，500 g，4 ℃离心5 min。弃上清，用4 ml HBSS溶液重悬细胞沉淀，用一次性吸管将细胞悬液缓慢叠加到3 ml 33% Percoll溶液上，每管加1 ml细胞悬液，注意保持清晰的界面。离心，800 g，升1降1，25 min，免疫细胞位于管底。
（9）洗涤：弃上清，用维持液重悬细胞沉淀，离心，2000 rpm，5 min，则沉淀为肝内免疫细胞。

以下是本方法提取的Kupffer细胞、MoMFs、以及中性粒细胞的圈门策略及效果图。

实验步骤都是在实践中不断优化的，以上实验步骤有些地方很繁琐，博士期间由于时间有限未能尝试简化条件验证效果，欢迎相关方向的家人们进一步优化条件，让我们实验既高效又简单！若有地方写得不够清楚，也欢迎一起交流讨论！

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